Javascript está actualmente desactivado no teu navegador.Cando javascript está desactivado, algunhas funcións deste sitio web non funcionarán.
Rexistra os teus datos específicos e os teus medicamentos específicos de interese e relacionaremos a información que proporcionas cos artigos da nosa extensa base de datos e enviarémosche unha copia en PDF por correo electrónico de forma oportuna.
Controlar o movemento de nanopartículas de óxido de ferro magnético para a entrega de citostáticos dirixidos
Autor Toropova Y, Korolev D, Istomina M, Shulmeyster G, Petukhov A, Mishanin V, Gorshkov A, Podyacheva E, Gareev K, Bagrov A, Demidov O
Yana Toropova,1 Dmitry Korolev,1 Maria Istomina,1,2 Galina Shulmeyster,1 Alexey Petukhov,1,3 Vladimir Mishanin,1 Andrey Gorshkov,4 Ekaterina Podyacheva,1 Kamil Gareev,2 Alexei Bagrov,5 Oleg Demidov6,71Almazov National Medical Centro de Investigación do Ministerio de Sanidade da Federación Rusa, San Petersburgo, 197341, Federación Rusa;2 Universidade Electrotécnica de San Petersburgo “LETI”, San Petersburgo, 197376, Federación Rusa;3 Centro de Medicina Personalizada, Centro Estatal de Investigación Médica Almazov, Ministerio de Saúde da Federación Rusa, San Petersburgo, 197341, Federación de Rusia;4FSBI "Instituto de Investigación da Gripe chamado AA Smorodintsev" Ministerio de Sanidade da Federación Rusa, San Petersburgo, Federación Rusa;5 Instituto Sechenov de Fisioloxía Evolutiva e Bioquímica, Academia Rusa de Ciencias, San Petersburgo, Federación Rusa;6 Instituto de Citoloxía RAS, San Petersburgo, 194064, Federación Rusa;7INSERM U1231, Facultade de Medicina e Farmacia, Universidade de Bourgogne-Franche Comté de Dijon, Francia Comunicación: Yana Toropova Centro Nacional de Investigación Médica Almazov, Ministerio de Sanidade da Federación Rusa, San Petersburgo, 197341, Federación Rusa Tel +7 981 952648700699 Correo electrónico [email protected] Antecedentes: un enfoque prometedor para o problema da toxicidade citostática é o uso de nanopartículas magnéticas (MNP) para a entrega de medicamentos dirixidos.Obxecto: Utilizar cálculos para determinar as mellores características do campo magnético que controla as MNP in vivo e avaliar a eficiencia da entrega de magnetróns de MNP a tumores de rato in vitro e in vivo.(MNPs-ICG).Realizáronse estudos de intensidade de luminiscencia in vivo en ratos tumorais, con e sen campo magnético no lugar de interese.Estes estudos realizáronse nun andamio hidrodinámico desenvolvido polo Instituto de Medicina Experimental do Centro Estatal de Investigación Médica de Almazov do Ministerio de Sanidade ruso.Resultado: o uso de imáns de neodimio promoveu a acumulación selectiva de MNP.Un minuto despois da administración de MNPs-ICG a ratos portadores de tumores, as MNPs-ICG acumúlanse principalmente no fígado.En ausencia e presenza dun campo magnético, isto indica a súa vía metabólica.Aínda que se observou un aumento da fluorescencia no tumor en presenza dun campo magnético, a intensidade da fluorescencia no fígado do animal non cambiou co paso do tempo.Conclusión: este tipo de MNP, combinado coa intensidade do campo magnético calculado, pode ser a base para o desenvolvemento dunha entrega controlada magnéticamente de fármacos citostáticos aos tecidos tumorais.Palabras clave: análise de fluorescencia, indocianina, nanopartículas de óxido de ferro, entrega de magnetróns de citostáticos, orientación tumoral
As enfermidades tumorais son unha das principais causas de morte en todo o mundo.Ao mesmo tempo, aínda existe a dinámica de aumento da morbilidade e mortalidade das enfermidades tumorais.1 A quimioterapia que se utiliza hoxe en día segue sendo un dos principais tratamentos para diferentes tumores.Ao mesmo tempo, o desenvolvemento de métodos para reducir a toxicidade sistémica dos citostáticos segue sendo relevante.Un método prometedor para resolver o seu problema de toxicidade é utilizar portadores a nanoescala para dirixir os métodos de administración de fármacos, que poden proporcionar unha acumulación local de fármacos nos tecidos tumorais sen aumentar a súa acumulación en órganos e tecidos sans.concentración.2 Este método permite mellorar a eficiencia e a orientación dos fármacos quimioterapéuticos nos tecidos tumorais, ao tempo que reduce a súa toxicidade sistémica.
Entre as diversas nanopartículas consideradas para a entrega selectiva de axentes citostáticos, as nanopartículas magnéticas (MNP) son de especial interese polas súas propiedades químicas, biolóxicas e magnéticas únicas, que aseguran a súa versatilidade.Polo tanto, as nanopartículas magnéticas poden usarse como sistema de calefacción para tratar tumores con hipertermia (hipertermia magnética).Tamén se poden utilizar como axentes diagnósticos (diagnóstico por resonancia magnética).3-5 Usando estas características, combinadas coa posibilidade de acumulación de MNP nunha área específica, mediante o uso dun campo magnético externo, a entrega de preparados farmacéuticos dirixidos abre a creación dun sistema de magnetrón multifuncional para dirixir os citostáticos ao sitio do tumor. Perspectivas.Tal sistema incluiría MNP e campos magnéticos para controlar o seu movemento no corpo.Neste caso, tanto os campos magnéticos externos como os implantes magnéticos colocados na zona do corpo que contén o tumor pódense utilizar como fonte do campo magnético.6 O primeiro método presenta graves deficiencias, incluíndo a necesidade de utilizar equipos especializados para a orientación magnética de fármacos e a necesidade de adestrar o persoal para realizar a cirurxía.Ademais, este método está limitado polo alto custo e só é adecuado para tumores "superficiais" próximos á superficie do corpo.O método alternativo de uso de implantes magnéticos amplía o ámbito de aplicación desta tecnoloxía, facilitando o seu uso en tumores localizados en diferentes partes do corpo.Tanto os imáns individuais como os imáns integrados no stent intraluminal pódense utilizar como implantes para o dano tumoral en órganos ocos para garantir a súa permeabilidade.Non obstante, segundo a nosa propia investigación inédita, estes non son o suficientemente magnéticos para garantir a retención de MNP do torrente sanguíneo.
A eficacia da administración de fármacos con magnetrón depende de moitos factores: as características do propio portador magnético e as características da fonte do campo magnético (incluíndo os parámetros xeométricos dos imáns permanentes e a intensidade do campo magnético que xeran).O desenvolvemento dunha tecnoloxía exitosa de administración de inhibidores celulares guiados magnéticamente debe implicar o desenvolvemento de portadores de fármacos magnéticos a nanoescala apropiados, avaliando a súa seguridade e desenvolvendo un protocolo de visualización que permita rastrexar os seus movementos no corpo.
Neste estudo, calculamos matematicamente as características óptimas do campo magnético para controlar o portador magnético de fármacos a nanoescala no corpo.Tamén se estudou a posibilidade de reter MNP a través da parede dos vasos sanguíneos baixo a influencia dun campo magnético aplicado con estas características computacionais en vasos illados de ratas.Ademais, sintetizamos conxugados de MNP e axentes fluorescentes e desenvolvemos un protocolo para a súa visualización in vivo.En condicións in vivo, en ratos modelo tumoral, estudouse a eficiencia de acumulación de MNP nos tecidos tumorais cando se administran sistémicamente baixo a influencia dun campo magnético.
No estudo in vitro utilizouse o MNP de referencia, e no estudo in vivo utilizouse o MNP recuberto de poliéster de ácido láctico (ácido poliláctico, PLA) que contén un axente fluorescente (indolecianina; ICG).MNP-ICG inclúese en No caso, use (MNP-PLA-EDA-ICG).
A síntese e as propiedades físicas e químicas do MNP foron descritas en detalle noutro lugar.7,8
Para sintetizar MNPs-ICG, primeiro producíronse conxugados PLA-ICG.Utilizouse unha mestura racémica en po de PLA-D e PLA-L cun peso molecular de 60 kDa.
Dado que o PLA e o ICG son ambos ácidos, para sintetizar os conxugados PLA-ICG, primeiro é necesario sintetizar un espaciador terminado en amino no PLA, que axuda a que ICG adsorba o espaciador.O espaciador sintetizouse usando etilendiamina (EDA), método de carbodiimida e carbodiimida soluble en auga, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC).O espaciador PLA-EDA sintetízase do seguinte xeito.Engade un exceso molar de 20 veces de EDA e un exceso molar de 20 veces de EDAC a 2 mL de solución de cloroformo PLA a 0,1 g/mL.A síntese realizouse nun tubo de ensaio de polipropileno de 15 ml nun agitador a unha velocidade de 300 min-1 durante 2 horas.O esquema de síntese móstrase na Figura 1. Repita a síntese cun exceso de 200 veces de reactivos para optimizar o esquema de síntese.
Ao final da síntese, a solución centrifugouse a unha velocidade de 3000 min-1 durante 5 minutos para eliminar o exceso de derivados de polietileno precipitados.A continuación, engadíronse 2 mL dunha solución ICG a 0,5 mg/mL en dimetilsulfóxido (DMSO) á solución de 2 mL.O axitador fíxase a unha velocidade de axitación de 300 min-1 durante 2 horas.O diagrama esquemático do conxugado obtido móstrase na Figura 2.
En 200 mg de MNP, engadimos 4 ml de conxugado PLA-EDA-ICG.Use un agitador LS-220 (LOIP, Rusia) para axitar a suspensión durante 30 minutos cunha frecuencia de 300 min-1.Despois, foi lavado con isopropanol tres veces e sometido a separación magnética.Use o dispersor ultrasónico UZD-2 (FSUE NII TVCH, Rusia) para engadir IPA á suspensión durante 5-10 minutos baixo acción ultrasónica continua.Despois do terceiro lavado con IPA, o precipitado foi lavado con auga destilada e resuspendido en solución salina fisiolóxica a unha concentración de 2 mg/ml.
Utilizouse o equipo ZetaSizer Ultra (Malvern Instruments, Reino Unido) para estudar a distribución de tamaño do MNP obtido na solución acuosa.Utilizouse un microscopio electrónico de transmisión (TEM) cun cátodo de emisión de campo STEM JEM-1400 (JEOL, Xapón) para estudar a forma e o tamaño do MNP.
Neste estudo, utilizamos imáns permanentes cilíndricos (grado N35; con revestimento protector de níquel) e os seguintes tamaños estándar (longitude do eixe longo × diámetro do cilindro): 0,5×2 mm, 2×2 mm, 3×2 mm e 5×2 mm.
O estudo in vitro do transporte de MNP no sistema modelo realizouse nun andamio hidrodinámico desenvolvido polo Instituto de Medicina Experimental do Centro Estatal de Investigación Médica de Almazov do Ministerio de Sanidade ruso.O volume do líquido circulante (auga destilada ou solución de Krebs-Henseleit) é de 225 ml.Como imáns permanentes úsanse imáns cilíndricos magnetizados axialmente.Coloque o imán nun soporte a 1,5 mm de distancia da parede interior do tubo de vidro central, co seu extremo orientado na dirección do tubo (vertical).O caudal do fluído no circuito pechado é de 60 L/h (correspondente a unha velocidade lineal de 0,225 m/s).A solución de Krebs-Henseleit úsase como fluído circulante porque é un análogo do plasma.O coeficiente de viscosidade dinámica do plasma é de 1,1–1,3 mPa∙s.9 A cantidade de MNP adsorbida no campo magnético determínase mediante espectrofotometría a partir da concentración de ferro no líquido circulante despois do experimento.
Ademais, realizáronse estudos experimentais sobre unha táboa de mecánica de fluídos mellorada para determinar a permeabilidade relativa dos vasos sanguíneos.Os principais compoñentes do soporte hidrodinámico móstranse na Figura 3. Os principais compoñentes do stent hidrodinámico son un bucle pechado que simula a sección transversal do sistema vascular modelo e un tanque de almacenamento.O movemento do fluído modelo ao longo do contorno do módulo dos vasos sanguíneos é proporcionado por unha bomba peristáltica.Durante o experimento, manteña a evaporación e o intervalo de temperatura necesario, e controle os parámetros do sistema (temperatura, presión, caudal de líquido e valor de pH).
Figura 3 Diagrama de bloques da configuración utilizada para estudar a permeabilidade da parede da arteria carótida.1-tanque de almacenamento, 2-bomba peristáltica, 3-mecanismo para introducir suspensión que contén MNP no bucle, 4-fluxómetro, 5-sensor de presión no bucle, 6-intercambiador de calor, 7-cámara con recipiente, 8-a fonte do campo magnético, 9-o globo con hidrocarburos.
A cámara que contén o recipiente consta de tres recipientes: un recipiente grande exterior e dous recipientes pequenos, polos que pasan os brazos do circuíto central.A cánula insírese no recipiente pequeno, o recipiente fíxase no recipiente pequeno e a punta da cánula está ben atada cun fío fino.O espazo entre o recipiente grande e o recipiente pequeno énchese con auga destilada e a temperatura mantense constante debido á conexión co intercambiador de calor.O espazo do pequeno recipiente énchese con solución de Krebs-Henseleit para manter a viabilidade das células dos vasos sanguíneos.O tanque tamén está cheo de solución de Krebs-Henseleit.O sistema de subministración de gas (carbono) úsase para vaporizar a solución no pequeno recipiente do tanque de almacenamento e na cámara que contén o recipiente (Figura 4).
Figura 4 A cámara onde se coloca o recipiente.1-Cánula para baixar vasos sanguíneos, 2-Cámara exterior, 3-Cámara pequena.A frecha indica a dirección do fluído do modelo.
Para determinar o índice de permeabilidade relativa da parede do vaso, utilizouse a arteria carótida de rata.
A introdución de suspensión de MNP (0,5 ml) no sistema ten as seguintes características: o volume interno total do tanque e do tubo de conexión no bucle é de 20 ml e o volume interno de cada cámara é de 120 ml.A fonte de campo magnético externo é un imán permanente cun tamaño estándar de 2 × 3 mm.Instálase encima dunha das cámaras pequenas, a 1 cm de distancia do recipiente, cun extremo mirando á parede do recipiente.A temperatura mantense a 37 °C.A potencia da bomba de rolo está configurada no 50%, o que corresponde a unha velocidade de 17 cm/s.Como control, tomáronse mostras nunha cela sen imáns permanentes.
Unha hora despois da administración dunha determinada concentración de MNP, tomouse unha mostra líquida da cámara.A concentración de partículas foi medida por un espectrofotómetro utilizando un espectrofotómetro UV-Vis Unico 2802S (United Products & Instruments, USA).Tendo en conta o espectro de absorción da suspensión de MNP, a medición realizouse a 450 nm.
Segundo as directrices Rus-LASA-FELASA, todos os animais son criados e criados en instalacións específicas libres de patóxenos.Este estudo cumpre con todas as normas éticas relevantes para experimentos e investigacións con animais e obtivo a aprobación ética do Centro Nacional de Investigación Médica de Almazov (IACUC).Os animais bebían auga ad libitum e alimentábanse regularmente.
O estudo realizouse en 10 ratos NSG machos inmunodeficientes de 12 semanas de idade anestesiados (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj, Jackson Laboratory, USA) 10, cun peso de 22 g ± 10%.Dado que a inmunidade dos ratos con inmunodeficiencia está suprimida, os ratos con inmunodeficiencia desta liña permiten o transplante de células e tecidos humanos sen rexeitamento do transplante.Os compañeiros de camada de diferentes gaiolas foron asignados aleatoriamente ao grupo experimental, e foron criados ou expostos sistemáticamente ao leito doutros grupos para garantir unha exposición igual á microbiota común.
A liña celular de cancro humano HeLa úsase para establecer un modelo de xenoinjerto.Cultiváronse as células en DMEM que contén glutamina (PanEco, Rusia), complementada con soro bovino fetal ao 10% (Hyclone, EUA), 100 CFU/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina.A liña celular foi proporcionada polo Laboratorio de Regulación da Expresión Xénica do Instituto de Investigación Celular da Academia Rusa de Ciencias.Antes da inxección, as células HeLa foron eliminadas do plástico de cultivo cunha solución de tripsina:Versene 1:1 (Biolot, Rusia).Despois do lavado, as células foron suspendidas en medio completo ata unha concentración de 5 × 106 células por 200 μL e diluídas con matriz de membrana basal (LDEV-FREE, MATRIGEL® CORNING®) (1:1, sobre xeo).A suspensión celular preparada inxectouse por vía subcutánea na pel da coxa do rato.Use calibres electrónicos para controlar o crecemento do tumor cada 3 días.
Cando o tumor alcanzou os 500 mm3, implantouse un imán permanente no tecido muscular do animal de experimentación preto do tumor.No grupo experimental (MNPs-ICG + tumor-M), inxectáronse 0,1 ml de suspensión de MNP e expuxéronse a un campo magnético.Utilizáronse animais enteiros non tratados como controis (fondo).Ademais, empregáronse animais inxectados con 0,1 ml de MNP pero non implantados con imáns (MNPs-ICG + tumor-BM).
A visualización de fluorescencia de mostras in vivo e in vitro realizouse na bioimaxe IVIS Lumina LT serie III (PerkinElmer Inc., EUA).Para a visualización in vitro, engadiuse aos pozos da placa un volume de 1 ml de conxugado PLA-EDA-ICG e MNP-PLA-EDA-ICG sintético.Tendo en conta as características de fluorescencia do colorante ICG, selecciónase o mellor filtro utilizado para determinar a intensidade luminosa da mostra: a lonxitude de onda máxima de excitación é de 745 nm e a lonxitude de onda de emisión é de 815 nm.Utilizouse o software Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.) para medir cuantitativamente a intensidade de fluorescencia dos pozos que conteñen o conxugado.
A intensidade de fluorescencia e a acumulación do conxugado MNP-PLA-EDA-ICG medironse en ratos modelo de tumor in vivo, sen a presenza e a aplicación dun campo magnético no lugar de interese.Os ratos foron anestesiados con isoflurano e despois inxectáronse 0,1 ml de conxugado MNP-PLA-EDA-ICG a través da vea da cola.Utilizáronse ratos non tratados como control negativo para obter un fondo fluorescente.Despois de administrar o conxugado por vía intravenosa, coloque o animal nunha etapa de quecemento (37 °C) na cámara da imaxe de fluorescencia IVIS Lumina LT serie III (PerkinElmer Inc.) mantendo a inhalación con anestesia con isoflurano ao 2%.Use o filtro incorporado de ICG (745–815 nm) para a detección de sinal 1 minuto e 15 minutos despois da introdución do MNP.
Para avaliar a acumulación de conxugado no tumor, cubriuse a área peritoneal do animal con papel, o que permitiu eliminar a fluorescencia brillante asociada á acumulación de partículas no fígado.Despois de estudar a biodistribución de MNP-PLA-EDA-ICG, os animais foron sacrificados humanamente por unha sobredose de anestesia con isoflurano para a posterior separación das áreas tumorais e a avaliación cuantitativa da radiación de fluorescencia.Use o software Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.) para procesar manualmente a análise do sinal da rexión de interese seleccionada.Tomáronse tres medidas para cada animal (n = 9).
Neste estudo, non cuantificamos a carga exitosa de ICG en MNPs-ICG.Ademais, non comparamos a eficiencia de retención de nanopartículas baixo a influencia de imáns permanentes de diferentes formas.Ademais, non avaliamos o efecto a longo prazo do campo magnético sobre a retención de nanopartículas nos tecidos tumorais.
As nanopartículas dominan, cun tamaño medio de 195,4 nm.Ademais, a suspensión contiña aglomerados cun tamaño medio de 1176,0 nm (Figura 5A).Posteriormente, a porción foi filtrada a través dun filtro centrífugo.O potencial zeta das partículas é de -15,69 mV (Figura 5B).
Figura 5 As propiedades físicas da suspensión: (A) distribución do tamaño das partículas;(B) distribución de partículas en potencial zeta;(C) Fotografía TEM de nanopartículas.
O tamaño das partículas é basicamente de 200 nm (Figura 5C), composto por un único MNP cun tamaño de 20 nm e unha capa orgánica conxugada PLA-EDA-ICG cunha densidade electrónica máis baixa.A formación de aglomerados en solucións acuosas pódese explicar polo módulo relativamente baixo da forza electromotriz das nanopartículas individuais.
Para imáns permanentes, cando a magnetización se concentra no volume V, a expresión integral divídese en dúas integrais, a saber, o volume e a superficie:
No caso dunha mostra cunha magnetización constante, a densidade de corrente é cero.Entón, a expresión do vector de indución magnética terá a seguinte forma:
Use o programa MATLAB (MathWorks, Inc., EUA) para o cálculo numérico, número de licenza académica ETU “LETI” 40502181.
Como se mostra na Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura-10, o campo magnético máis forte é xerado por un imán orientado axialmente desde o extremo do cilindro.O raio de acción efectivo é equivalente á xeometría do imán.Nos imáns cilíndricos cun cilindro cuxa lonxitude é maior que o seu diámetro, o campo magnético máis forte obsérvase na dirección axial-radial (para o compoñente correspondente);polo tanto, un par de cilindros cunha relación de aspecto maior (diámetro e lonxitude) a adsorción de MNP é a máis efectiva.
Fig. 7 A compoñente da intensidade de indución magnética Bz ao longo do eixe Oz do imán;o tamaño estándar do imán: liña negra 0,5 × 2 mm, liña azul 2 × 2 mm, liña verde 3 × 2 mm, liña vermella 5 × 2 mm.
Figura 8 O compoñente de indución magnética Br é perpendicular ao eixe magnético Oz;o tamaño estándar do imán: liña negra 0,5 × 2 mm, liña azul 2 × 2 mm, liña verde 3 × 2 mm, liña vermella 5 × 2 mm.
Figura 9 A compoñente de intensidade de indución magnética Bz á distancia r do eixe final do imán (z=0);o tamaño estándar do imán: liña negra 0,5 × 2 mm, liña azul 2 × 2 mm, liña verde 3 × 2 mm, liña vermella 5 × 2 mm.
Figura 10 Compoñente de indución magnética ao longo da dirección radial;tamaño estándar do imán: liña negra 0,5 × 2 mm, liña azul 2 × 2 mm, liña verde 3 × 2 mm, liña vermella 5 × 2 mm.
Pódense usar modelos hidrodinámicos especiais para estudar o método de entrega de MNP aos tecidos tumorais, concentrar as nanopartículas na zona diana e determinar o comportamento das nanopartículas en condicións hidrodinámicas no sistema circulatorio.Os imáns permanentes pódense utilizar como campos magnéticos externos.Se ignoramos a interacción magnetostática entre as nanopartículas e non consideramos o modelo de fluído magnético, abonda con estimar a interacción entre o imán e unha soa nanopartícula cunha aproximación dipolo-dipolo.
Onde m é o momento magnético do imán, r é o vector radio do punto onde se atopa a nanopartícula e k é o factor do sistema.Na aproximación dipolo, o campo do imán ten unha configuración similar (Figura 11).
Nun campo magnético uniforme, as nanopartículas só xiran ao longo das liñas de forza.Nun campo magnético non uniforme, a forza actúa sobre el:
Onde está a derivada dunha dirección l dada.Ademais, a forza tira as nanopartículas cara ás áreas máis irregulares do campo, é dicir, aumentan a curvatura e a densidade das liñas de forza.
Polo tanto, é desexable utilizar un imán (ou cadea magnética) suficientemente forte con evidente anisotropía axial na zona onde se atopan as partículas.
A táboa 1 mostra a capacidade dun só imán como fonte de campo magnético suficiente para capturar e reter MNP no leito vascular do campo de aplicación.