Javascript está desactivado no teu navegador. Cando Javascript está desactivado, algunhas funcións deste sitio web non funcionarán.
Rexistra os teus datos específicos e os medicamentos específicos que che interesen e nós compararemos a información que nos proporciones cos artigos da nosa extensa base de datos e enviarémosche unha copia en PDF por correo electrónico de maneira oportuna.
Controlar o movemento de nanopartículas de óxido de ferro magnético para a administración dirixida de citostáticos
Autor Toropova Y, Korolev D, Istomina M, Shulmeyster G, Petukhov A, Mishanin V, Gorshkov A, Podyacheva E, Gareev K, Bagrov A, Demidov O
Yana Toropova, 1 Dmitry Korolev, 1 Maria Istomina, 1, 2 Galina Shulmeyster, 1 Alexey Petukhov, 1, 3 Vladimir Mishanin, 1 Andrey Gorshkov, 4 Ekaterina Podyacheva, 1 Kamil Gareev, 2 Alexei Bagrov, 5 Oleg Demidov6, 71Centro Nacional de Investigación Médica Almazov do Ministerio de Sanidade da Federación Rusa, San Petersburgo, 197341, Federación Rusa; 2 Universidade Electrotécnica de San Petersburgo “LETI”, San Petersburgo, 197376, Federación Rusa; 3 Centro de Medicina Personalizada, Centro Estatal de Investigación Médica Almazov, Ministerio de Sanidade da Federación Rusa, San Petersburgo, 197341, Federación Rusa; 4FSBI “Instituto de Investigación da Gripe que leva o nome de AA Smorodintsev” Ministerio de Sanidade da Federación Rusa, San Petersburgo, Federación Rusa; 5 Instituto Sechenov de Fisioloxía Evolutiva e Bioquímica, Academia Rusa das Ciencias, San Petersburgo, Federación Rusa; 6 Instituto RAS de Citoloxía, San Petersburgo, 194064, Federación Rusa; 7INSERM U1231, Facultade de Medicina e Farmacia, Universidade de Borgoña-Franco Condado de Dijon, Francia Comunicación: Centro Nacional de Investigación Médica Yana ToropovaAlmazov, Ministerio de Sanidade da Federación Rusa, San Petersburgo, 197341, Federación Rusa Tel. +7 981 95264800 4997069 Correo electrónico [email protected] Antecedentes: Unha abordaxe prometedora para o problema da toxicidade citostática é o uso de nanopartículas magnéticas (NPM) para a administración dirixida de fármacos. Obxectivo: Empregar cálculos para determinar as mellores características do campo magnético que controla as NPM in vivo e avaliar a eficiencia da administración por magnetrón de NPM a tumores de rato in vitro e in vivo. Úsase a NPM-ICG. Realizáronse estudos de intensidade de luminescencia in vivo en ratos con tumores, con e sen campo magnético no lugar de interese. Estes estudos realizáronse nunha estrutura hidrodinámica desenvolvida polo Instituto de Medicina Experimental do Centro Estatal de Investigación Médica Almazov do Ministerio de Sanidade ruso. Resultado: O uso de imáns de neodimio promoveu a acumulación selectiva de nanopartículas de iononas (MNP). Un minuto despois da administración de MNP-ICG a ratos con tumores, as MNP-ICG acumúlanse principalmente no fígado. En ausencia e presenza dun campo magnético, isto indica a súa vía metabólica. Aínda que se observou un aumento da fluorescencia no tumor en presenza dun campo magnético, a intensidade da fluorescencia no fígado do animal non cambiou co tempo. Conclusión: Este tipo de MNP, combinado coa intensidade calculada do campo magnético, pode ser a base para o desenvolvemento da administración controlada magneticamente de fármacos citostáticos aos tecidos tumorais. Palabras clave: análise de fluorescencia, indocianina, nanopartículas de óxido de ferro, administración de citostáticos por magnetrón, focalización tumoral
As enfermidades tumorais son unha das principais causas de morte en todo o mundo. Ao mesmo tempo, a dinámica de aumento da morbilidade e mortalidade das enfermidades tumorais segue a existir.1 A quimioterapia utilizada hoxe en día segue a ser un dos principais tratamentos para diferentes tumores. Ao mesmo tempo, o desenvolvemento de métodos para reducir a toxicidade sistémica dos citostáticos segue a ser relevante. Un método prometedor para resolver o seu problema de toxicidade é o uso de vehículos a nanoescala para dirixirse aos métodos de administración de fármacos, que poden proporcionar a acumulación local de fármacos nos tecidos tumorais sen aumentar a súa acumulación en órganos e tecidos sans. concentración.2 Este método permite mellorar a eficiencia e a direccionamento dos fármacos quimioterapéuticos nos tecidos tumorais, ao tempo que reduce a súa toxicidade sistémica.
Entre as diversas nanopartículas consideradas para a administración dirixida de axentes citostáticos, as nanopartículas magnéticas (NPM) son de especial interese debido ás súas propiedades químicas, biolóxicas e magnéticas únicas, que garanten a súa versatilidade. Polo tanto, as nanopartículas magnéticas poden empregarse como sistema de quecemento para tratar tumores con hipertermia (hipertermia magnética). Tamén poden empregarse como axentes de diagnóstico (diagnóstico por resonancia magnética). 3-5 Usando estas características, combinadas coa posibilidade de acumulación de NPM nunha área específica, mediante o uso dun campo magnético externo, a administración de preparacións farmacéuticas dirixidas abre a creación dun sistema magnetrón multifuncional para dirixir os citostáticos ao sitio do tumor. Perspectivas. Tal sistema incluiría NPM e campos magnéticos para controlar o seu movemento no corpo. Neste caso, tanto os campos magnéticos externos como os implantes magnéticos colocados na área corporal que contén o tumor poden utilizarse como fonte do campo magnético. 6 O primeiro método ten serias deficiencias, incluíndo a necesidade de usar equipos especializados para a focalización magnética de fármacos e a necesidade de formar persoal para realizar cirurxía. Ademais, este método ten limitacións por un custo elevado e só é axeitado para tumores "superficiais" próximos á superficie do corpo. O método alternativo de empregar implantes magnéticos amplía o ámbito de aplicación desta tecnoloxía, facilitando o seu uso en tumores situados en diferentes partes do corpo. Tanto os imáns individuais como os imáns integrados no stent intraluminal pódense empregar como implantes para danos tumorais en órganos ocos para garantir a súa permeabilidade. Non obstante, segundo a nosa propia investigación non publicada, estes non son o suficientemente magnéticos para garantir a retención de nanopartículas magnéticas (NP) na corrente sanguínea.
A eficacia da administración de fármacos por magnetrón depende de moitos factores: as características do propio soporte magnético e as características da fonte do campo magnético (incluíndo os parámetros xeométricos dos imáns permanentes e a intensidade do campo magnético que xeran). O desenvolvemento dunha tecnoloxía exitosa de administración de inhibidores celulares guiados magneticamente debe implicar o desenvolvemento de soportes de fármacos magnéticos axeitados a nanoescala, a avaliación da súa seguridade e o desenvolvemento dun protocolo de visualización que permita rastrexar os seus movementos no corpo.
Neste estudo, calculamos matematicamente as características óptimas do campo magnético para controlar o portador de fármacos a nanoescala magnética no corpo. Tamén se estudou a posibilidade de reter nanopartículas magnéticas (MNP) a través da parede do vaso sanguíneo baixo a influencia dun campo magnético aplicado con estas características computacionais en vasos sanguíneos de rata illados. Ademais, sintetizamos conxugados de MNP e axentes fluorescentes e desenvolvemos un protocolo para a súa visualización in vivo. En condicións in vivo, en ratos modelo tumoral, estudouse a eficiencia de acumulación de MNP en tecidos tumorais cando se administran sistematicamente baixo a influencia dun campo magnético.
No estudo in vitro, empregamos a nanopartícula de magnesio (MNP) de referencia e, no estudo in vivo, empregamos a MNP recuberta con poliéster de ácido láctico (ácido poliláctico, PLA) que contén un axente fluorescente (indolecianina; ICG). A MNP-ICG está incluída no caso de uso (MNP-PLA-EDA-ICG).
A síntese e as propiedades físicas e químicas das nanopartículas de magnesio foron descritas en detalle noutros lugares. 7,8
Para sintetizar nanopartículas de iones de carbono (MNP)-ICG, primeiro producíronse conxugados de PLA-ICG. Empregouse unha mestura racémica en po de PLA-D e PLA-L cun peso molecular de 60 kDa.
Dado que o PLA e o ICG son ácidos, para sintetizar conxugados de PLA-ICG, primeiro cómpre sintetizar un espazador terminado en amino no PLA, que axude á quimiabsorción do ICG ao espazador. O espazador sintetizouse usando etilendiamina (EDA), o método da carbodiimida e carbodiimida soluble en auga, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC). O espazador de PLA-EDA sintetízase do seguinte xeito. Engádese un exceso molar de 20 veces de EDA e un exceso molar de 20 veces de EDAC a 2 mL de solución de cloroformo de PLA a 0,1 g/mL. A síntese levouse a cabo nun tubo de ensaio de polipropileno de 15 mL nun axitador a unha velocidade de 300 min-1 durante 2 horas. O esquema de síntese móstrase na Figura 1. Repita a síntese cun exceso de 200 veces de reactivos para optimizar o esquema de síntese.
Ao final da síntese, a solución centrifugouse a unha velocidade de 3000 min-1 durante 5 minutos para eliminar o exceso de derivados de polietileno precipitados. Despois, engadíronse 2 mL dunha solución de ICG de 0,5 mg/mL en dimetilsulfóxido (DMSO) á solución de 2 mL. O axitador fíxase a unha velocidade de axitación de 300 min-1 durante 2 horas. O diagrama esquemático do conxugado obtido móstrase na Figura 2.
Engadimos 4 mL de conxugado PLA-EDA-ICG a 200 mg de MNP. Empregouse un axitador LS-220 (LOIP, Rusia) para axitar a suspensión durante 30 minutos a unha frecuencia de 300 min-1. Despois, lavouse con isopropanol tres veces e sometéuse a separación magnética. Empregouse un dispersor ultrasónico UZD-2 (FSUE NII TVCH, Rusia) para engadir IPA á suspensión durante 5-10 minutos baixo acción ultrasónica continua. Despois do terceiro lavado con IPA, o precipitado lavouse con auga destilada e resuspendiuse en solución salina fisiolóxica a unha concentración de 2 mg/mL.
O equipo ZetaSizer Ultra (Malvern Instruments, Reino Unido) empregouse para estudar a distribución de tamaño das nanopartículas magnéticas (NPM) obtidas na solución acuosa. Para estudar a forma e o tamaño das NPM empregouse un microscopio electrónico de transmisión (TEM) cun cátodo de emisión de campo JEM-1400 STEM (JEOL, Xapón).
Neste estudo, empregamos imáns permanentes cilíndricos (grao N35; con revestimento protector de níquel) e os seguintes tamaños estándar (lonxitude do eixe longo × diámetro do cilindro): 0,5×2 mm, 2×2 mm, 3×2 mm e 5×2 mm.
O estudo in vitro do transporte de nanopartículas magnéticas (NPM) no sistema modelo levouse a cabo nunha estrutura hidrodinámica desenvolvida polo Instituto de Medicina Experimental do Centro Estatal de Investigación Médica Almazov do Ministerio de Sanidade ruso. O volume do líquido circulante (auga destilada ou solución de Krebs-Henseleit) é de 225 mL. Como imáns permanentes utilízanse imáns cilíndricos magnetizados axialmente. Coloque o imán nun soporte a 1,5 mm da parede interior do tubo de vidro central, co seu extremo orientado na dirección do tubo (vertical). O caudal de fluído no circuíto pechado é de 60 L/h (correspondente a unha velocidade lineal de 0,225 m/s). A solución de Krebs-Henseleit utilízase como fluído circulante porque é un análogo do plasma. O coeficiente de viscosidade dinámica do plasma é de 1,1–1,3 mPa∙s. 9 A cantidade de NPM adsorbida no campo magnético determínase mediante espectrofotometría a partir da concentración de ferro no líquido circulante despois do experimento.
Ademais, realizáronse estudos experimentais sobre unha táboa de mecánica de fluídos mellorada para determinar a permeabilidade relativa dos vasos sanguíneos. Os principais compoñentes do soporte hidrodinámico móstranse na Figura 3. Os principais compoñentes do stent hidrodinámico son un circuíto pechado que simula a sección transversal do sistema vascular do modelo e un tanque de almacenamento. O movemento do fluído do modelo ao longo do contorno do módulo do vaso sanguíneo é proporcionado por unha bomba peristáltica. Durante o experimento, manteña a vaporización e o rango de temperatura requirido e monitorice os parámetros do sistema (temperatura, presión, caudal de líquido e valor de pH).
Figura 3 Diagrama de bloques da configuración empregada para estudar a permeabilidade da parede da arteria carótide. 1-tanque de almacenamento, 2-bomba peristáltica, 3-mecanismo para introducir a suspensión que contén MNP no bucle, 4-medidor de fluxo, 5-sensor de presión no bucle, 6-intercambiador de calor, 7-cámara con recipiente, 8-a fonte do campo magnético, 9-o balón con hidrocarburos.
A cámara que contén o recipiente consta de tres recipientes: un recipiente grande exterior e dous recipientes pequenos, polos que pasan os brazos do circuíto central. A cánula insírese no recipiente pequeno, o recipiente está enfiado no recipiente pequeno e a punta da cánula está firmemente atada cun arame fino. O espazo entre o recipiente grande e o recipiente pequeno énchese con auga destilada e a temperatura permanece constante debido á conexión co intercambiador de calor. O espazo do recipiente pequeno énchese cunha solución de Krebs-Henseleit para manter a viabilidade das células dos vasos sanguíneos. O tanque tamén se énche con solución de Krebs-Henseleit. O sistema de subministración de gas (carbono) utilízase para vaporizar a solución no recipiente pequeno no tanque de almacenamento e na cámara que contén o recipiente (Figura 4).
Figura 4 A cámara onde se coloca o recipiente. 1-Cánula para baixar os vasos sanguíneos, 2-Cámara exterior, 3-Cámara pequena. A frecha indica a dirección do fluído do modelo.
Para determinar o índice de permeabilidade relativa da parede do vaso, empregouse a arteria carótide de rata.
A introdución da suspensión de MNP (0,5 ml) no sistema ten as seguintes características: o volume interno total do tanque e do tubo de conexión no bucle é de 20 ml, e o volume interno de cada cámara é de 120 ml. A fonte de campo magnético externo é un imán permanente cun tamaño estándar de 2 × 3 mm. Está instalado enriba dunha das cámaras pequenas, a 1 cm de distancia do recipiente, cun extremo orientado cara á parede do recipiente. A temperatura mantense a 37 °C. A potencia da bomba de rolos está establecida no 50 %, o que corresponde a unha velocidade de 17 cm/s. Como control, tomáronse mostras nunha cela sen imáns permanentes.
Unha hora despois da administración dunha concentración determinada de MNP, tomouse unha mostra líquida da cámara. A concentración de partículas mediuse cun espectrofotómetro empregando o espectrofotómetro UV-Vis Unico 2802S (United Products & Instruments, EUA). Tendo en conta o espectro de absorción da suspensión de MNP, a medición realizouse a 450 nm.
Segundo as directrices de Rus-LASA-FELASA, todos os animais son criados e mantidos en instalacións específicas libres de patóxenos. Este estudo cumpre con todas as normas éticas pertinentes para a experimentación e a investigación con animais e obtivo a aprobación ética do Centro Nacional de Investigación Médica Almazov (IACUC). Os animais beberon auga ad libitum e alimentaronse regularmente.
O estudo realizouse en 10 ratos NSG machos inmunodeficientes anestesiados de 12 semanas de idade (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj, Jackson Laboratory, EUA) 10, cun peso de 22 g ± 10 %. Dado que a inmunidade dos ratos inmunodeficientes está suprimida, os ratos inmunodeficientes desta liña permiten o transplante de células e tecidos humanos sen rexeitamento do transplante. Os compañeiros de camada de diferentes gaiolas asignáronse aleatoriamente ao grupo experimental e foron criados en conxunto ou expostos sistematicamente á cama doutros grupos para garantir a mesma exposición á microbiota común.
A liña celular de cancro humano HeLa utilízase para establecer un modelo de xenoenxerto. As células cultiváronse en DMEM que contiña glutamina (PanEco, Rusia), suplementado cun 10 % de soro fetal bovino (Hyclone, EUA), 100 UFC/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. A liña celular foi amablemente proporcionada polo Laboratorio de Regulación da Expresión Xénica do Instituto de Investigación Celular da Academia Rusa das Ciencias. Antes da inxección, as células HeLa retiráronse do plástico de cultivo cunha solución de tripsina:verseno 1:1 (Biolot, Rusia). Despois do lavado, as células suspendéronse en medio completo a unha concentración de 5 × 106 células por 200 μL e diluíronse con matriz de membrana basal (LDEV-FREE, MATRIGEL® CORNING®) (1:1, en xeo). A suspensión celular preparada inxectouse por vía subcutánea na pel da coxa do rato. Utilízanse pinzas electrónicas para monitorizar o crecemento tumoral cada 3 días.
Cando o tumor alcanzou os 500 mm3, implantouse un imán permanente no tecido muscular do animal de experimentación preto do tumor. No grupo experimental (MNP-ICG + tumor-M), inxectáronse 0,1 mL de suspensión de MNP e expuxéronse a un campo magnético. Usáronse animais enteiros non tratados como controis (fondo). Ademais, utilizáronse animais inxectados con 0,1 mL de MNP pero sen implantación de imáns (MNP-ICG + tumor-BM).
A visualización por fluorescencia de mostras in vivo e in vitro realizouse no bioimager IVIS Lumina LT series III (PerkinElmer Inc., EUA). Para a visualización in vitro, engadiuse un volume de 1 mL de conxugado sintético PLA-EDA-ICG e MNP-PLA-EDA-ICG aos pozos da placa. Tendo en conta as características de fluorescencia do colorante ICG, selecciónase o mellor filtro utilizado para determinar a intensidade luminosa da mostra: a lonxitude de onda de excitación máxima é de 745 nm e a lonxitude de onda de emisión é de 815 nm. Empregouse o software Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.) para medir cuantitativamente a intensidade de fluorescencia dos pozos que contiñan o conxugado.
A intensidade de fluorescencia e a acumulación do conxugado MNP-PLA-EDA-ICG medíronse en ratos modelo tumoral in vivo, sen a presenza nin a aplicación dun campo magnético no lugar de interese. Os ratos foron anestesiados con isoflurano e, a continuación, inxectáronse 0,1 mL de conxugado MNP-PLA-EDA-ICG a través da vea da cola. Os ratos non tratados utilizáronse como control negativo para obter un fondo fluorescente. Despois de administrar o conxugado por vía intravenosa, coloque o animal nunha etapa de quecemento (37 °C) na cámara do lector de imaxes de fluorescencia IVIS Lumina LT series III (PerkinElmer Inc.) mentres se mantén a inhalación con anestesia con isoflurano ao 2 %. Utilice o filtro incorporado do ICG (745–815 nm) para a detección do sinal 1 minuto e 15 minutos despois da introdución de MNP.
Para avaliar a acumulación de conxugado no tumor, a área peritoneal do animal foi cuberta con papel, o que permitiu eliminar a fluorescencia brillante asociada á acumulación de partículas no fígado. Tras estudar a biodistribución de MNP-PLA-EDA-ICG, os animais foron sacrificados de forma humanitaria mediante unha sobredose de anestesia con isoflurano para a posterior separación das áreas tumorais e a avaliación cuantitativa da radiación de fluorescencia. Empregouse o software Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.) para procesar manualmente a análise de sinal da rexión de interese seleccionada. Realizáronse tres medicións para cada animal (n = 9).
Neste estudo, non cuantificamos o éxito da carga de ICG en nanopartículas de imáns permanentes (MNP-ICG). Ademais, non comparamos a eficiencia de retención de nanopartículas baixo a influencia de imáns permanentes de diferentes formas. Ademais, non avaliamos o efecto a longo prazo do campo magnético na retención de nanopartículas nos tecidos tumorais.
Predominan as nanopartículas, cun tamaño medio de 195,4 nm. Ademais, a suspensión contiña aglomerados cun tamaño medio de 1176,0 nm (Figura 5A). Posteriormente, a porción filtrouse a través dun filtro centrífugo. O potencial zeta das partículas é de -15,69 mV (Figura 5B).
Figura 5. Propiedades físicas da suspensión: (A) distribución do tamaño das partículas; (B) distribución das partículas ao potencial zeta; (C) fotografía TEM de nanopartículas.
O tamaño das partículas é basicamente de 200 nm (Figura 5C), compostas por unha única nanopartícula de núcleo macizo (MNP) cun tamaño de 20 nm e unha capa orgánica conxugada de PLA-EDA-ICG cunha densidade de electróns máis baixa. A formación de aglomerados en solucións acuosas pódese explicar polo módulo relativamente baixo da forza electromotriz das nanopartículas individuais.
Para imáns permanentes, cando a magnetización se concentra no volume V, a expresión integral divídese en dúas integrais, concretamente o volume e a superficie:
No caso dunha mostra cunha magnetización constante, a densidade de corrente é cero. Entón, a expresión do vector de indución magnética adoptará a seguinte forma:
Empregar o programa MATLAB (MathWorks, Inc., EUA) para o cálculo numérico, licenza académica ETU “LETI” número 40502181.
Como se mostra na Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura-10, o campo magnético máis forte é o xerado por un imán orientado axialmente desde o extremo do cilindro. O raio de acción efectivo é equivalente á xeometría do imán. Nos imáns cilíndricos cun cilindro cuxa lonxitude é maior que o seu diámetro, o campo magnético máis forte obsérvase na dirección axial-radial (para o compoñente correspondente); polo tanto, un par de cilindros cunha relación de aspecto maior (diámetro e lonxitude) de adsorción de MNP é a máis efectiva.
Fig. 7 A compoñente da intensidade de indución magnética Bz ao longo do eixe Oz do imán; o tamaño estándar do imán: liña negra 0,5×2 mm, liña azul 2×2 mm, liña verde 3×2 mm, liña vermella 5×2 mm.
Figura 8 O compoñente de indución magnética Br é perpendicular ao eixe do imán Oz; o tamaño estándar do imán: liña negra 0,5×2 mm, liña azul 2×2 mm, liña verde 3×2 mm, liña vermella 5×2 mm.
Figura 9. Compoñente Bz da intensidade de indución magnética á distancia r desde o eixe final do imán (z=0); tamaño estándar do imán: liña negra 0,5×2 mm, liña azul 2×2 mm, liña verde 3×2 mm, liña vermella 5×2 mm.
Figura 10 Compoñente de indución magnética ao longo da dirección radial; tamaño estándar do imán: liña negra 0,5 × 2 mm, liña azul 2 × 2 mm, liña verde 3 × 2 mm, liña vermella 5 × 2 mm.
Pódense empregar modelos hidrodinámicos especiais para estudar o método de administración de nanopartículas de imáns (MNP) aos tecidos tumorais, concentrar nanopartículas na área obxectivo e determinar o comportamento das nanopartículas en condicións hidrodinámicas no sistema circulatorio. Os imáns permanentes pódense empregar como campos magnéticos externos. Se ignoramos a interacción magnetostática entre as nanopartículas e non consideramos o modelo de fluído magnético, abonda con estimar a interacción entre o imán e unha única nanopartícula cunha aproximación dipolo-dipolo.
Onde m é o momento magnético do imán, r é o vector de radio do punto onde se atopa a nanopartícula e k é o factor do sistema. Na aproximación dipolar, o campo do imán ten unha configuración similar (Figura 11).
Nun campo magnético uniforme, as nanopartículas só rotan ao longo das liñas de forza. Nun campo magnético non uniforme, a forza actúa sobre elas:
Onde é a derivada dunha dirección dada l. Ademais, a forza atrae as nanopartículas cara ás zonas máis irregulares do campo, é dicir, a curvatura e a densidade das liñas de forza aumentan.
Polo tanto, é desexable usar un imán (ou cadea de imáns) suficientemente forte con anisotropía axial evidente na zona onde se atopan as partículas.
A táboa 1 mostra a capacidade dun só imán como fonte de campo magnético suficiente para capturar e reter nanopartículas (MNP) no leito vascular do campo de aplicación.